全扫描（full-scan）、DDA 和 DIA 综合评估的工作流程示意图如图 1 所示。在这项研究中，研究人员测试了 134 种标准品混合物（StdMix）和 1 份尿液样本（Urine）(原始浓度和 100 倍稀释)。LC-MS 分析在 RP (+) 和 HILIC (-) 中进行，收集数据后，对三种数据采集方式进行 peak 数量、定量精度、MS2 质谱的数量和质量以及便利性等五方面进行比较。
表1.通过三种数据采集方法分析的标准混合物中确认的代谢物数量
* StdMix（L）中检测到的代谢物与 StdMix（H）中检测到的代谢物及相应百分比
首先研究人员人工核查标准品的保留时间、准确分子量和 MS2 谱图后，从表 1 的结果中显示，在 RP (+) 和 HILIC (-) 模式下，原始标准混合物（StdMix（H））在全扫描和 DIA 中确认的代谢物数量始终比 DDA 中略高。为了评估不同数据采集模式检测低丰度代谢物的能力，研究人员使用稀释的标准混合物（StdMix（L））进行了重复分析。研究人员在 RP (+) 和 HILIC (-) 分析中，发现与预期的一样，StdMix（L）检测到的代谢物数量比 StdMix (H) 显著减少。与 StdMix (H) 结果相比，全扫描同样检测到了最多的代谢物数量，但 DDA 在被识别的代谢物数量中下降最大，在检测低丰度代谢物方面 DDA 不如全扫描和 DIA 灵敏。
接下来、研究人员进一步在全扫描、DDA 和 DIA 模式下对人类尿液样本进行非靶向分析。使用 MS-DIAL 软件对尿液样本中的 peak 提取、比对数据和代谢产物初步鉴定。数据处理参数手动优化，以达到最佳 peak 提取性能。
图 2. 在（A）RP（+），（B）HILIC（-）分析中通过三种采集方法分析的尿液样品中检测到的总 peak 数量、MS1 注释和 MS2 匹配的 peak 数量。
研究人员为了评估三种数据采集模式的分析差异，计算了检测到的 MS1 注释和 MS2 匹配的 peak 的总数 (图 2)。在 RP (+) 和 HILIC (-) 分析中，无论尿液样本浓度如何，全扫描和 DIA 模式比 DDA 模式能够覆盖更多的 peak。
图 3.（A）RP（+），（B）HILIC（-）分析中的 peakMS 信号强度的 RSD 分布。
除了检测到的 peak 的数量，研究人员还对尿液样本进行了技术重复（一式三份）。经 MS-DIAL 峰校准后，计算 peak 强度的相对标准偏差 (RSD)。如图 3 所示，三种采集模式结果中大于 80% 的 peak 的 RSD 均小于 20%，且在全扫描和 DIA 中准确度佳 (RSD < 5%)。这一趋势在不同浓度尿液样本分析中结果是一致的。DDA 始终具有最小的 peak 百分比（RSD < 5%），且与样品类型、浓度、电离极性或色谱方法无关。说明 DDA 的定量准确度略低于全扫描和 DIA。
图4.（A）RP（+）（B）HILIC（-）分析尿液样品中 DDA 和 DIA 检测到的 MS2 重叠特征
利用人类尿液样本，研究人员比较了 DDA 和 DIA 模式下产生的 MS2 质谱的数量和质量。在 Urine (H)-RP (+),Urine (H)-HILIC (-), Urine (L)-RP (+), Urine (L)-HILIC (-) 分析中，DDA 模式下平均有 43% 的 peak 具有相应的 MS2 谱图。DIA 分析中 100％的 peak 具有相应的 MS2 质谱图。此外，DDA 和 DIA 结果中的具有 MS2 质谱的共同 peak 以 Venn 图显示（图 4）。如图所示，DIA 比 DDA 能够生成更多的 MS2 质谱图。但是，研究人员发现 DDA 可以生成一些 DIA 中没有找到的峰形较差、丰度较低的 MS2 谱图。
图 5. RP（+）和 HILIC（-）分析中，DDA 与 DIA 的质谱相似性得分分布。
除了 MS2 谱图数量的比较，研究人员还评估了由 DDA 和 DIA 分析产生的 RP (+) 和 HILIC (-) 分析产生的 Urine (H）MS2 谱图的质量。DDA 和 DIA 检测到的所有常见 peak 的 Dot product score、该数值的大小与谱图质量呈正相关。分布如图 5 所示。由于代谢浓度不同，MS2 谱图的分布与代谢物标准相似，且有几种代谢物匹配点积得分极低。DDA 和 DIA 的点积分数分布结果表明，DDA 产生的 MS2 质谱具有更好的分数，因此得到更好的谱图质量。
图 6. 三种数据采集方法评估的总结
研究人员对非靶向代谢组学中全扫描（full scan）、DDA 和 DIA 模式进行了综合评估。每种数据采集模式都有其独特性和局限性，会显著影响代谢组数据的质量。总的来说如图 6 所示，（1）全扫描 peak 数量最多，其次是 DIA 和 DDA。（2）因结果中超过 80% 的 peak 的 RSD 低于 20% 在 LC-MS 中是可以被接受的，故这三种采集模式的定量准确度具有一致性。（3）在 DDA 和 DIA 这两种能够得到 MS2 谱图的采集模式相比，DIA 的 MS2 谱图数量高于 DDA，但 DDA 的 MS2 谱图质量高于 DIA。另外，DDA 具有使用方便、可以自动化进行鉴定、缩短工作流程时间的特点，在非靶代谢组学中十分具有竞争力。
百趣生物作为代谢组学科技服务领域的开拓者与领军者，一直以来在非靶向代谢组学中使用 DDA 采集模式，为客户提供优质高效的技术服务。
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