一、研究背景灯台叶(Alstonia scholaris)作为傣族民间常用中药，具有清热解毒、止咳平喘等作用。近年来，在抗肿瘤、抗炎和抗菌等方面显示出重要的潜在药用价值。基于灯台叶在民间亦用于抗肿瘤组方，研究者对课题组前期富集分离的单萜吲哚生物碱化合物进行抗肿瘤活性筛选，鲜有发现活性显著的细胞毒药理作用。由于单萜吲哚生物碱(monoterpenoid indole alkaloids, MIAs)和单萜喹啉生物碱(monoterpenoid quinoline alkaloids, MQAs)在生源上具有相同生源途径，本实验借助ACD/MS Workbook Suite模块功能对灯台叶总生物碱提取物进行质谱和二级质谱分析，对指认的二级质谱MS/MS含有喹啉母核碎片峰的化合物进行定向分离，确证四种骨架新颖的喹啉生物碱化合物——Alstoschoquinolines A−D（1−4）。活性筛选显示化合物3可通过影响谷胱甘肽稳态发挥抗结肠癌细胞毒作用，表明从富含单萜吲哚生物碱的傣药灯台叶中靶向挖掘的单萜喹啉生物碱化合物有显著的抗结肠癌细胞毒活性。该部分工作由云南大学罗晓东研究员课题组于近期发表于《Journal of Organic Chemistry》，DOI: 10.1021/acs.joc.4c02450。
二、化合物的分离与结构鉴定1、ACD/MS Workbook Suite指导化合物分离通过液相色谱-质谱（LC/MS）检测的直接分离技术，从灯台树(Alstonia scholaris)叶中分离出四种全新喹啉生物碱化合物——Alstoschoquinolines A−D（1−4）。这些化合物代表了三种新颖的化学骨架，其中1和2是含六个连续手性碳的具有5/6/5骈合喹啉骨架的化合物；而化合物3和4则是分别具有6/6/6/6和6/6/8/6四环的新颖桥环骨架化合物（图1）。在生源上，它们可能来自于corynantheine型单萜吲哚生物碱，通过一系列的氧化和重排反应生成。
图1. Alstoschoquinolines A−D (1−4)的结构式
由于单萜吲哚生物碱(monoterpenoid indole alkaloids，MIAs)和单萜喹啉生物碱(monoterpenoid quinoline alkaloids, MQAs)具有类似的生源途径，研究者依据前期建立的单萜吲哚生物碱数据库和分离到的少量喹啉化合物进行排重和二级质谱MS/MS碎片峰指认，借助ACD/MS Workbook Suite模块对灯台叶总生物碱提取物进行质谱和二级质谱MS/MS碎片峰分析，对分子量在(m/z 200.0000-400.0000)的含偶数氮(不含氮)的质谱峰进行二级质谱分析，对确证二级质谱MS/MS含有喹啉母核碎片峰化合物进行定向分离。结果表明化合物1 (m/z= 355.1656)经MS/MS碎片峰识别，指认含有m/z=130.0653的喹啉碎片及其碎片群；化合物3 (m/z= 279.1490)经MS/MS碎片峰识别，表明含有m/z=128.0487的喹啉碎片及其碎片群；化合物4 (m/z= 279.1479)经MS/MS碎片峰识别，表明含有m/z=130.0636的喹啉碎片及其碎片群（图2-图9）。以化合物1−4为例，具体MS/MS碎片峰指认如下：
图2. 化合物1的ESI-MS 数据
图3. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物1的MS/MS喹啉碎片峰 (m/z=130.0653)
图4. 化合物2的ESI-MS 数据
图5. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物2的喹啉碎片峰 (m/z=130.0642)
图6. 化合物3的ESI-MS 数据
图7. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物3的喹啉碎片峰 (m/z=128.0487)
图8. 化合物4的ESI-MS 数据图9. 借用ACD/MS Workbook Suite模块指认化合物4的喹啉碎片峰 (m/z=130.0636)
2、ACD/Structure Elucidator的关键作用在结构解析的过程中，ACD/Structure Elucidator Suite软件发挥了至关重要的作用。该软件通过计算机辅助结构解析（CASE）专家系统，对化合物1-4的结构进行了解析和验证。具体体现如下：
基于谱图数据生成候选结构研究者将LC-MS指导下分离的化合物1-4的1D和2D NMR谱图信息以及质谱数据导入ACD/Structure Elucidator程序。程序根据这些数据，结合经验光谱数据和特征偶合常数，自动创建了分子连接图（MCD，图10）。基于核磁数据经验，当碳谱化学位移值大于100时，碳原子设定为sp²杂化状态；当碳谱化学偏移值小于90时，碳原子被设定为sp³杂化状态；当化学偏移值大于170时，若有必要则将碳原子设定为羰基碳。同时连接1个苯环，以便减少计算时间（图11）。在计算过程中，程序还实施了光谱内部过滤，丢弃平均碳偏差大于3ppm或最大碳偏差大于15ppm的结构。以化合物1为例，经过这些筛选条件后，最终确定了1个结构（No.2，ID:10）具有较低的dA、dN和dI值，且没有不合理的二维相关性，如绿色单箭头和蓝色双箭头所示的不合理相关，从而确定该结构为化合物1的正确结构（图12）。
图10. 自动生成的化合物1分子连接图(MCD，红色碳表示sp2杂化，绿色碳表示sp3杂化，黑色碳表示不确定碳原子杂化状态)
图11. 编辑后的化合物 1 的分子连接图（MCD）
图12. ACD/Structure Elucidator 生成的化合物1的部分候选结构
预测化学位移与实验值对比对于每个候选结构，ACD/Structure Elucidator使用三种经验方法预测13C{1H}化学位移，并计算实验值与预测值之间的平均偏差（HOSE算法: dA；神经网络算法: dN；增量法: dI）。通常，正确的结构具有平均偏差值dn小于3 ppm，并且在所有候选结构中排名靠前。例如，在化合物3的结构验证中（图13），通过对比实验值和计算值，确定了化合物3的结构（No.1，ID:2），其平均偏差值符合正确结构的特征(dn<3 ppm)。而另一个候选分子（No.2，ID:1）有一个碳原子最大碳偏差dn大于15ppm(红色标注)，进一步表明其不是正确结构。
图13. ACD/Structure Elucidator 生成的化合物3的结构
程序还能够检测HMBC和1H-1H COSY中的非标准相关性（n > 3），并以绿色/红色单箭头和蓝色双箭头分别表示。这些相关性的检测有助于进一步验证结构的合理性。例如，在化合物1的结构分析中(图12)，通过检测到的非标准相关性，进一步确认了其结构的正确性。
提高结构解析效率与可靠性
加速结构解析过程传统的结构解析方法需要研究者手动分析大量的谱图数据，耗费大量的时间和精力。而ACD/Structure Elucidator Suite软件通过自动化地生成候选结构、筛选结构以及验证结构，大大加速了结构解析的进程。例如，在该研究中，对于每个化合物，程序能够在较短的时间内生成并筛选出正确的结构，提高了研究的整体效率。
提高结构解析的可靠性软件基于大量的经验数据和先进的算法，能够更准确地预测化学位移和相关性，从而提高结构解析的可靠性。在该研究中，通过软件的分析，所确定的化合物结构均具有较低的偏差值和合理的相关性，这表明软件在结构解析中发挥了关键作用，提高了结构解析的准确性和可信度。
三、抗肿瘤活性与机制在对四种化合物进行抗肿瘤活性测试时，研究者们发现，化合物3在对抗肺癌细胞系H1299、肝癌细胞系MHCC97H以及结肠癌细胞（HCT116和CT-26）时表现出显著的抑制效果，其IC50值分别为8.0、11.2、4.8和5.5 μM。进一步的机制研究揭示，化合物3通过干扰谷胱甘肽（GSH）循环，破坏氧化还原稳态，从而触发活性氧（ROS）凋亡。具体来说，化合物3显著增加了ROS+细胞的百分比，降低了线粒体膜电位（MMP），并显著提高了caspase-3/7的活性，这些数据表明化合物3通过内在途径诱导结肠癌细胞凋亡。此外，通过添加GSH（100 μM）可以部分恢复由化合物3引起的ROS诱导凋亡，进一步证实了其通过干扰GSH再生诱导细胞凋亡的机制（图14）。
图14：化合物3通过影响谷胱甘肽稳态发挥抗肿瘤作用
四、结论与展望
综上所述，这项研究不仅分离鉴定了四种具有新颖结构的喹啉生物碱，而且发现化合物3对结肠癌细胞具有显著的抑制效果，其作用机制为干扰谷胱甘肽循环，诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞的克隆扩张。这一发现为抗癌药物的研发提供了新的天然产物候选分子，也为进一步的结构修饰和药理学研究提供了新颖骨架。同时，ACD/Structure Elucidator Suite软件在结构解析中的高效应用，再次证明了其在天然产物化学研究中的重要价值，为科研工作者提供了一个强大的工具，以加速从复杂天然产物中挖掘新颖小分子实体化合物的进程。
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